Los autores sitúan la acción en una aldea de las montañas de Moravia, en época contemporánea. Acto I: El molino de la vieja Buryja
Con Buryja viven su nieto Števa y el medio hermano de éste, Laca Klemeň. Jenůfa, la nieta adoptiva de la anciana, está triste por la ausencia de Števa y reza a la virgen para que le conceda casarse con él. Ese día se sabrá quienes, entre los jóvenes del pueblo, deberán incorporarse al ejército; entre ellos se encuentra Števa. Laca, enamorado en secreto de Jenůfa, reprocha a su abuela la preferencia por su hermano. Pero todos, a excepción de Laca, se alegran al enterarse de que el joven ha sido exceptuado del servicio militar. La Sacristana, viuda de uno de los hijos de Buryja, recibe la noticia con desagrado. Llegan los aldeanos y también Števa, que borracho maltrata a Jenůfa y busca despertarle celos. Se arma una fiesta que es interrumpida por la Sacristana, quien enérgicamente dispone que su hijastra Jenůfa se casará con Števa, solo si este abandona la bebida. Los dos jóvenes se quedan solos y ella le pide a él que cambie de conducta, pero este le responde con liviandad y se aleja, diciéndole que sus mejillas son las más hermosas entre las de las demás jóvenes de la comarca. Llega Laca, le ofrece a la muchacha una flor que Števa arrojara instantes atrás, y le recuerda que aquel sólo ve en ella la belleza exterior. A pesar de que en su fuero íntimo conoce los sentimientos de Števa, Jenůfa se enfurece con Laca. Es que en realidad, lleva en su vientre el fruto de ese amor y por esa razón quiere casarse. Laca intenta abrazar a la muchacha, es rechazado y en un rapto de ira, saca una navaja y le corta la mejilla. Se arrepiente en el acto y le confiesa el amor que siente por ella. Jenůfa grita y corre desesperada hacia la casa, mientras que Barena, una criada del molino, cuenta lo sucedido a Buryja y al Capataz, que reprende a Laca por su acción brutal.
Acto II: La casa de la Sacristana Jenůfa esperó a su hijo escondida en lo de su madrastra y olvidada por el padre del niño. La Sacristana, que a pesar de su severidad y de reprocharle su pecado la quiere, le ha dado un somnífero para poder conversar en secreto con Števa. Pero la conversación no da resultado: el joven no tiene ningún interés en Jenůfa y se ha comprometido con Karolka, la hija del Juez del Pueblo. Enterada de todo, la Sacristana decide que lo mejor para salvar el honor de su hijastra será la muerte del niño. Llega Laca, se pone al tanto de las cosas y le comunica a la mujer su decisión de casarse con Jenůfa, salvando así el honor mancillado de la muchacha. Pero la Sacristana lo engaña, al decirle que el niño ha muerto. Al quedarse sola, la mujer, desesperada pero decidida a salvar el honor de su hijastra, sale con el bebé con el propósito de arrojarlo a las heladas aguas del río que baña la comarca. Jenůfa despierta y no encuentra a su hijo. Regresa la Sacristana y ante la pregunta de la joven, que quiere a su bebé, le responde que mientras dormía murió de fiebre. La consuela, le dice que olvide al infiel Števa y que tome como marido a Laca. Cuando este llega ya no es rechazado: se casará con él. La madrastra los bendice, mientras maldice a Števa. Pero luego es asaltada por pensamientos funestos, cree escuchar los gemidos del bebé, no soporta el remordimiento y cae desmayada.
Acto III: En la casa de la Sacristana
Luego de dos meses, todo está listo para la boda entre Jenůfa y Laca. La abuela Buryja preside la ceremonia y la Sacristana también está presente, aunque muy inquieta en el momento en que llega el Juez del Pueblo con su esposa. Laca invita a su novia a olvidar el pasado y dice no guardar rencor hacia Števa, que está entre los invitados a la boda. Llega un grupo de muchachas guiadas por Barena, para cantar y ofrendar flores a los esposos. Pero todo se interrumpe abruptamente cuando Jano, un pastor del lugar, viene a buscar al Juez con la noticia de que encontró un bebé muerto y congelado en el río. Todos salen horrorizados a excepción de la Sacristana, Buryja y Števa. Regresa Jenůfa, que con espanto ha reconocido a su hijo y revela que Števa es el padre. La creen responsable de esa muerte y se precipitan sobre ella, pero Laca la defiende, cuando ante el estupor de todos la Sacristana se confiesa autora del delito. Jenůfa la perdona, pero la madrastra es conducida por el Juez: deberá soportar el peso de la justicia. Todos salen del lugar y la joven le pide a Laca que la deje abandonada a su suerte, pues se considera indigna. El joven se niega a abandonarla y está dispuesto a permanecer con ella para siempre. Jenůfa le tiende sus brazos y juntos comenzarán una nueva etapa en sus vidas.
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