A la hora de pensar en el estreno no era difícil que la mira se colocase en el Teatro Nacional de Praga, el más importante de ese rincón del imperio austrohúngaro y por entonces bajo la dirección de Karel Kovařovic, personaje que jugará un papel nada menor en el destino de Jenůfa. Por ahora digamos que solo se limitó a rechazar la primera obra maestra de Janáček, por un motivo más bien personal: años antes, precisamente en 1887, había ofrecido en la ciudad de Brno su ópera Los novios, que fue objeto de comentarios burlones por parte de nuestro compositor; con su rechazo, saboreaba la revancha.

Así que a Janáček no le quedó otro remedio que pensar en el Teatro Checo de Brno, escenario que tenía su prestigio por ser el más importante de la capital morava, aunque más modesto que el de Praga. Llegó la navidad de 1903, los coreutas y los solistas ya tenían aprendidas sus partes, pero los miembros de la orquesta aún no habían leído las suyas. Con esta perspectiva los ensayos no resultaron lo suficientemente óptimos y el estreno de Jenůfa, previsto para el 14 de enero, debió correrse una semana.

Jenůfa (Její pastorkyňa) se estrenó el 21 de enero de 1904. Bajo la dirección de Cyril M. Hrazdira, actuaron: Marie Kabeláčová (Jenůfa), Alois Staněk-Doubravský (Laca), Bohdan Procházka (Števa), Leopoldina Hanusová-Svobodová (Sacristana), Věra Pivoňková (Abuela Buryja), Karel Benýško (Capataz del molino), Alois Pivoňka (Juez), Ema Kučerová (Esposa del Juez) y Růžena Kasperová (Karolka). Contra las intenciones del autor la orquesta fue reducida a 29 miembros, con la omisión de importantes instrumentos como el arpa, el clarinete bajo y el corno inglés. Pero el nivel del elenco y la calidad del director fueron tan buenos, que la obra conoció una gran recepción por parte del público, cuya positiva respuesta fue en aumento a lo largo de los tres actos, hasta culminar con grandes ovaciones para Janáček y Gabriela Preissová. Debido al éxito se llevaron a cabo 11 representaciones que incluyeron una gira por el sur de Bohemia; con la marcha de la temporada la orquesta se redujo aún más, lo que no impidió el éxito y la gran aceptación de la obra. Con este saldo tan positivo, nada impedía que la mira se dirigiese nuevamente a Praga.