Los autores sitúan la acción en Roma, en junio de 1800. Acto I
Iglesia Sant' Andrea della Valle
Angelotti, ex cónsul de la República de Roma, huye del Castel Sant’Angelo (la prisión) y se refugia en la iglesia Sant'Andrea della Valle. Según un mensaje que le enviara su hermana, la Marquesa Attavanti, en la capilla familiar encontrará ropas femeninas para disfrazarse y huir de la ciudad. El hombre se esconde en el interior de la capilla. Aparece el Sacristán, que cree haber advertido ruidos pero solamente encuentra el canasto con la comida del pintor Mario Cavaradossi.
Llega el pintor para retomar su trabajo: un cuadro con la imagen de María Magdalena, en la cual el Sacristán reconoce a una dama que días atrás vio rezar dentro de la iglesia. Sin embargo, el artista solo piensa en Floria Tosca, su amada, una célebre cantante de ópera.
Cuando el sacristán se retira, Angelotti se presenta ante Cavaradossi, que lo ayudará en la huida. Se escucha la voz de Tosca y el pintor le ofrece comida al fugitivo antes de que se oculte nuevamente. Entra Tosca. Está convencida de haber escuchado voces y al descubrir el parecido entre la Magdalena del cuadro y la Marquesa Attavanti, estallan sus celos. Finalmente acepta las explicaciones de Cavaradossi y se retira.
Vuelve a aparecer Angelotti y Cavaradossi le ofrece como refugio su casa en las afueras, hasta que abandone la ciudad. El disparo de un cañón que proviene del Castel Sant'Angelo da aviso de que el prisionero se ha fugado, y Cavaradossi decide acompañarlo hasta su casa.
El Sacristán entra jubiloso para comunicarle a Cavaradossi la noticia de que Napoleón Bonaparte fue derrotado, pero no lo encuentra. Con fervor da la nueva a los monaguillos, pero el júbilo se interrumpe al llegar el Barón Scarpia, el jefe de la policía de Roma. Registra la capilla de los Attavanti y encuentra un abanico con el escudo de armas de la familia: deduce que alguien ayudó a Angelotti en su fuga.
Nuevamente llega Tosca en busca de Cavaradossi. Scarpia le sale al paso y le sugiere que su amante se ha ido con la dama del cuadro. En un nuevo arranque de celos, la mujer decide ir a la casa de campo para sorprender a Mario con la marquesa. Scarpia ordena a su agente Spoletta que la siga sin ser visto: la celosa mujer los guiará hasta Angelotti. Pero, además, mientras se celebra el Te Deum, Scarpia confiesa su otra intención, que es la de poseer a la cantante.
Acto II
El despacho de Scarpia en el Palacio Farnese
En el interior de su despacho en el Palacio Farnese, Scarpia medita sobre sus deseos carnales y la búsqueda de Angelotti. Desde una ventana abierta se escucha una fiesta y el Barón da la orden de que Tosca sea conducida ante él, una vez que finalice su intervención en la cantata que se celebra en honor a la victoria sobre Napoleón. Llega Spoletta y le notifica a su jefe que durante el allanamiento a la propiedad de Cavaradossi no encontraron al fugitivo, pero que en cambio apresaron al pintor Cavaradossi. Lo traen ante Scarpia, que comienza a interrogarlo pero no obtiene respuestas. Llega Tosca y el pintor le susurra que no diga una palabra acerca de todo lo que vio en su propiedad. Scarpia hace que lo conduzcan a la cámara de torturas y comienza a interrogar a la mujer acerca del paradero de Angelotti. Tosca no habla y se horroriza al escuchar los gritos de su amado, hasta que no resiste más y confiesa el lugar donde se oculta el fugitivo. Cavaradossi es introducido nuevamente. Ensangrentado por los tormentos, se enfurece con Tosca cuando descubre que confesó. Inesperadamente se anuncia que, contrario a lo que creían, Bonaparte venció en la batalla de Marengo. Cavaradossi saca fuerzas, festeja, desafía a Scarpia y se lo llevan al calabozo con violencia.
Scarpia le dice a Tosca que su amante será fusilado, a menos que ella ceda a sus deseos carnales. Ordena el fusilamiento, pero Tosca, en medio de la angustia y la repulsión, le dice que accederá a sus deseos. El Barón le hace saber que antes de otorgarle la libertad, habrá que simular la ejecución: no se puede conceder gracia abiertamente. Llega la noticia de que Angelotti se suicidó antes de ser encontrado, y Scarpia ordena a Spoletta que el fusilamiento de Cavaradossi deberá ser simulado, como se hizo con el “Conde Palmieri”; esto no es más que un doble mensaje: el final del pintor está decidido. Pero cuando se queda a solas con Scarpia, antes de ceder, Tosca exige un salvoconducto para huir de Roma junto a Cavaradossi. El Barón accede y comienza a redactar el documento. Al terminar se arroja sobre Tosca para poseerla, pero se encuentra con que esta le entierra un puñal que encontró sobre una mesa. Luego de dar muerte al sádico Barón, Tosca le arranca el salvoconducto de la mano, coloca dos candelabros a los costados de su cuerpo inerte y deposita un crucifijo sobre su pecho ensangrentado. Por último abandona el despacho, rumbo al Castel Sant´Angelo.
Acto III
Terraza del Castel Sant 'Angelo
Es el amanecer. Se escucha el canto de un pastor y las campanadas de las iglesias romanas. Traen a Cavaradossi y un carcelero le anuncia que solo le queda una hora de vida. A cambio de entregarle un valioso anillo, el pintor consigue que le permita escribir unas líneas a Tosca. Entra la mujer y se precipita hacia su amante, le muestra el salvoconducto, le relata lo sucedido y le pide que sea lo más natural posible durante el simulacro de fusilamiento. El pelotón se prepara, los fusiles apuntan y disparan contra el pintor, que cae al suelo. Al retirarse los soldados Tosca se aproxima, mueve el cuerpo de su amado y descubre que todo fue un engaño: Mario está muerto.
Se escuchan voces de alarma y Tosca se da cuenta de que los esbirros encontraron el cadáver de Scarpia. Cuando Spoletta y Sciarrone intentan detenerla, sube rápidamente a una muralla y se arroja al vacío.
